Фиалка трехцветная в научной медицине применяются в качестве отхаркивающего средства при катарах верхних дыхательных путей, при застарелом кашле, при бронхите. Часто отвар фиалок применяют внутрь от грыжи, зубной боли, при женских заболеваниях, кровотечениях.
В народной медицине фиалка в виде настоя, отвара или чая применяется как мочегонное, потогонное и "кровоочистительное" средство. В отварах внутрь и наружно в виде примочек и ванн ее назначают при золотухе, рахите, против сыпи у детей (диатезе, детских экземах, туберкулезе кожи) и при других кожных заболеваниях. Также водный настой травы фиалки трехцветной рекомендуют при ревматизме, подагре, артритах.